Terapia con Células Madre para Neumonía por Influenza A

Las células madre de la vía aérea distal producen alvéolos in vitro y durante la regeneración pulmonar después de la infección por influenza H1N1

Imagen tomada con fines académicos de https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867411011731

El objetivo del estudio es comprender el alcance y la secuencia molecular de la regeneración alveolar y el papel de las células madre en este proceso. El tipo de célula madre utilizado fue células madre bronquioalveolares, o BASC, que expresan tanto los marcadores de células Clara (CC10) como los marcadores de células alveolares tipo II (AT2), y linaje de las células Clara Scgb1a1 + (CC10) en ratones.  Se clonaron las células derivadas de vías respiratorias. Mediante marcadores celulares, se identificaron a las células que expresaban p63, en los bronquios y en el parénquima pulmonar lesionado por el virus. A pesar del daño extenso pulmonar, se demostró que células que expresan p63 en los bronquiolos sufren una expansión y dispersión masiva a los sitios del parénquima pulmonar afectado. De igual manera, se demostró que la célula madre de la vía aérea distal (DASC), tiene el potencial único de diferenciarse a los linajes alveolares, con lo que tienen un papel importante en la regeneración alveolar. A largo plazo, este estudio proporciona una guía para la mejora terapeútica de la regeneración pulmonar por células que expresan p63 en ensamblaje alveolar por DASC Humanos in vitro.

Clonación y seguimiento regional específico de células madre de Pulmón humano.

Imagen tomada con fines académicos de https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867411011731#bib7

Bibliografía:

1. Kumar PA., Hu Y., Yamamoto Y., Hoe NB., Seok Wei T., Mu D., et al. Distal Airway Stem Cells Yield Alveoli In Vitro and during Lung Regeneration following H1N1 Influenza Infection. Cell Press [Internet]. 2011 [Citado el 29 dic 19]; 147 (3): 525-538. Disponible en https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867411011731#bib7

Planta transgénica en la Neumonía viral

Lechuga transgénica  que expresa el antígeno de superficie, neuranimidasa, de la influenza H1N1 

Con el fin de desarrollar procesos alternativos para la producción de vacunas debido a la alta demanda global, se diseñó una planta transgénica llamada Lactuca sativa L. con la proteína Neuranimidasa de la cepa H1N1. El vector de expresión de la planta se denominó pKcNAn, y fue introducido en la lechuga por transformación mediada por Agrobacterium. El método de obtención fue Knock In. Los ratones  que fueron inoculados con extractos de lechuga transgénica mostraron una respuesta inmune contra el antígeno NA; lo cual demuestra que la Neuranimidasa producida en plantas es antigénica y genera inmunogenicidad contra el virus de la influenza altamente patógena.

Análisis de PCR para detectar el gen de Neuranimidasa en Plantas Transgénicas

Imagen tomada con fines académicos de https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0304423812001203

Usos de Transgénicos

Ventajas
1. Se utilizan como modelos de investigación de enfermedades.
2. Se utilizan para la producción de productos terapéuticos (Biofármacos y vacunas).
3. Uso en terapia génica.
4. Alimentos con mejores propiedades alimenticias.
5. Aumento en la producción de alimentos.

Desventajas
1. Posibles efectos adversos en la salud humana, tales como alergias.
2.  Inestabilidad genética.
3. Invasión de ecosistemas.
4. Desconocimiento de efectos a largo plazo.
5. Resistencia a fármacos.

Bibliografía:
1. Lui CW., Chen JJW., Kang CC., Wu CH. Transgenic lettuce (Lactuca sativa L.) expressing H1N1 influenza surface antigen (neuraminidase). Scientia Horticulturae [Internet]. 2012[Citado el 22 dic 19]; 139: 8-13. Disponible en https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0304423812001203
2.  Alimentos Transgénicos.[Internet]. s.f.[Citado el 22 dic 19]. Disponible en https://alimentostransgenicos.info/organismos/

ADN recombinante artificial en Neumonía Viral

T: Producción de las proteínas recombinantes NS1 y NEP del virus de la influenza A H1N1 en Escherichia coli, purificación y obtención de anticuerpos monoclonales.
O: Tratamiento: Obtención de proteínas recombinantes para producción de anticuerpos anti-NS1 y anti-NEP.
G: Genes M y NS que codifican proteínas NEP y NS1.
E.R: No especifíca.
E.L: DNA Ligasa T4
V:  pQE-80L. Vectores recombinantes: pQNEP pmd 09 y pQ-NS1 pmd 09.
C.R: Procariota: E. coli BL21-NEP y BL21-NS1
M.T.G:  Transformación.
M.I.C: Cultivo, Cromatografía, Electroforesis, Western-blot, Determinación de proteínas por el método de Sedmak y Grossberg, Inoculación en ratones cepa BALB/c.

Expresión de las proteínas NEP y NS1 en E. coli BL21

Imagen tomada con fines académicos de https://repositorioinstitucional.buap.mx/bitstream/handle/20.500.12371/634/759217T.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Bibliografía: 
1. Martínez MM. Producción de las proteínas recombinantes NS1 y NEP del virus de la influenza A H1N1 en Escherichia coli, purificación y obtención de anticuerpos monoclonales. Universidad Autónoma de Puebla: Tesis Doctoral [Internet]. 2017 [Citado el 15 dic 19]. Disponible en https://repositorioinstitucional.buap.mx/bitstream/handle/20.500.12371/634/759217T.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Recombiación de ácidos nucleicos en la Naturaleza

Durante la meiosis, ocurre un fenómeno denominado Recombinación Homóloga, en el cual, a partir de dos genotipos de diferente procedencia se combinan y conforman un nuevo genotipo distinto. Es así que en secuencias similares y homólogas de ADN de los cromosomas apareados de los progenitores, se produce un entrecruzamiento. Tiene lugar en el crossing over de la meiosis I, y como consecuencia se da el intercambio de material genético, lo cual provoca una diversidad genética en la descendencia.  

Imagen tomada con fines académicos de https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Recombinacion-homologa

Bibliografía: 

1. Peiró P. Recombinación Homóloga. Universitat Autònoma de Barcelona [Internet]. 2017 [Citado el 08 dic 19]. Disponible en http://bioinformatica.uab.cat/base/documents/genetica_gen201617/portfolio/recombinaci%C3%B3n%20hom%C3%B3loga%202017_5_16P18_52_26.pdf

PCR de miRNAs y Microarray para el Diágnostico de Infección por Virus de la Influenza A.

Imagen tomada con fines académicos de https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6039551/

La expresión diferencial de miRNAs se vincula con la Infección por el Virus de la Influenza A. Los niveles aumentados de miR-148 y la disminución de  niveles de miR-31 y miR-29a son biomarcadores diagnósticos para las de infecciones graves. En microarrays de miARN y PCR se hallaron miARN vinculados con la patogénesis de la enfermedad, entre los que hallamos niveles de miR-229-5p, -335, -664 y -1260 aumentados, mientras niveles de miR-18a,-26a,-30a,-34b,-185,-576-3p,-628-3p,-665,-765 y -1285 se encontraban disminuídos.

miRNA modulan la Replicación del Virus de la Influenza

Imagen tomada con fines académicos de https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6039551/

Bibliografía:
1. Nguyen TH.,  Liu X., Zhong Su Z., Chen-Yu Hsu A.,  Foster P., Yang  M. Potential Role of MicroRNAs in the Regulation of Antiviral Responses to Influenza Infection.  Front Imunnol [Internet]. 2018 [Citado el 01 dic 19]. Disponible en https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6039551/

Microarray para subclasificación del virus de la influenza A

Imagen tomada con fines académicos de https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0017529

El virus de la Influenza A se puede subclasificar de acuerdo a la Hemaglutinina (16 subtipos) y Neuranimidasas (9 subtipos). Como diagnóstico se puede utlizar Microarrays de dos tipos. El microarray de secuenciación, se utiliza para determinar las secuencias de nucleótidos de HA y NA para la clasificación de los virus. Y por su parte, Microarray de hibridación utiliza conjuntos de sondas de oligonucleótidos inmovilizados que forman complejos con ADNc virus-específicos  etiquetados con marcadores fluorescentes. 

Figura 1. Patrón de hibridación de microarrays obtenido para amplicones de diferentes subtipos de neuraminidasa y hemaglutinina del virus de la Influenza A e histogramas respectivos.

Imagen tomada con fines académicos de https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0017529

Bibliografía:

1. Ryabinin VA, Kostina EV, Masakova GA, Neverov AA, Chumakov KM, Sinyakov AN. Universal Oligonucleotide Microarray for Sub-Typing of Influenza A Virus. Journals Plos [Internet]. 2011 [citado el 24 nov de 2019]. Disponible en https://journals.plos.org/plosone/article/file?id=10.1371/journal.pone.0017529&type=printable

Ensayo de PCR para detección de Virus de la Influenza A

                                          

Tema: Detección directa de virus de influenza A y B en menos de 20 minutos utilizando un ensayo de PCR rápida disponible comercialmente.

Objetivo: Detectar Virus de la Influenza A y B, de marea rápida y eficiente, con el fin de obtener un diagnóstico e identificación adecuados y poder brindar un tratamiento correcto.

Muestra: Hisopados Nasofaringeos colocados en 3 ml de VTM.

Tipo de ADN: ARN genómico Viral

Genes a amplificar: TNF, NOS3, HLA-B, Bcl-2.

Extracción de ADN:

Se utilizó el analizador Roche Cobas Liat.

PCR en Tiempo Real (Ensayo Cobas Liat): Se utilizó el analizador Roche Cobas Liat y sus instrucciones. Automatiza la interpretación de los resultados, y en la pantalla del analizador Liat se muestra un informe de detección de influenza A o B detectada o no.

Roche Cobas Liat.

Imagen tomada con fines didácticos de https://roche63-h.assetsadobe2.com/is/image/content/dam/diagnostics/us/en/products/c/cobas-liat/cobas-liat-operation-slide.jpg?wid=321&hei=189&cropn=0.07,0,0.86,1

Sensibilidad Analítica y Especificidad Analítica:

·       Sensibilidad del 99,2% (intervalo de confianza [IC] del 95%, 95,1% a 99,9%) para la gripe A y el 100% ((IC 95%, 83.1% a 100%) para influenza B.

·       Especificidad para influenza A y influenza B 100%

Bibliografía:

1. Binnicker MJ., Espy MJ., Irish CL., Vetter EA. Direct Detection of Influenza A and B Viruses in Less Than 20 Minutes Using a Commercially Available Rapid PCR Assay. Journal ASM [Internet]. 2015 [citado el 17 de nov de 2019]; 53 (7): 2353-2354. Disponible en https://jcm.asm.org/content/53/7/2353.short

Prueba de Tamizaje y prueba confirmatoria para Neumonía Viral

Prueba de Tamizaje: El ensayo FARP es una prueba de ácido nucleico multiplexada capaz de  de detectar  20 patógenos respiratorios, entre ellos: influenza A, influenza A subtipo H1, influenza A subtipo H3, influenza A subtipo 2009 H1, influenza B.

Prueba Confirmatoria: La técnica de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) múltiple es útil para la detección de virus de la influenza A, B y subtipos A H1N1, pdm09, y A H3N2. 

¿Cómo obtener alta especificidad en resultados de one-step RT-PCR?

                             
Bibliografía: 
1.  Crotty MP., Meyers S., Hampton N., Bledsoe S., Ritchie D., et al.  Impact of antibacterials on subsequent resistance and clinical outcomes in adult patients with viral pneumonia: an opportunity for stewardship. Critical Care [Internet]. 2015 [citado el 10 de nov de 2019]; 19 (404). Disponible en https://ccforum.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13054-015-1120-5

 

Alteraciones de la Epigenómica por Virus de la Influenza A

                            

Los miRNA específicos regulan la expresión de genes y proteínas para la diferencias celular de vías respiratorias humanas. La infección por el virus de la Influenza A desregula la expresión de algunos miRNA. Entre ellos, se encontró un aumento en miR-55, asociado con la regulación negativa de KGF durante la reparación pulmonar post-infección y regula la función de las células TCD8 inducidas por el virus. De igual manera se halló alteraciones en miR-29, miR-30, miR-21 y let-7, el cual puede actuar como supresor tumoral. 

miR-155 regula la lesión pulmonar y morbilidad durante la recuperación de la infección por influenza.

A: Morbilidad medida por pérdida de peso. B: Expresión inflamatoria de citosinas en el homogeneizado de pulmón. C; expresión del gen profibrótico por RT-PCR cuantitativa. D: Lesión pulmonar y contenido de colágeno por tinción OHP.
Imagen tomada con fines educativos de https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0002944017300627

Referencias Bibliográficas:
1. Pociask D., Robinson K., Chen K., McHugh K., Clay E., Huang G. Epigenetic and Transcriptomic Regulation of Lung Repair during Recovery from Influenza Infection. The Americal Journal of Pathology [Internet]. 2017 [citado el 3 de nov de 2019]. 187 (4): 851-863. Disponible en https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0002944017300627

Alteraciones de la Traducción del Virus de la Influenza en Neumonía

Imagen tomada con fines educativos de https://steemitimages.com/640x0/https://cdn.steemitimages.com/DQmZwmjfZftx38KXk6VHrPPvEuBtAkebbzXad6woduQVHzY/image.png

La simplicidad de la estructura secundaria de la secuencia de la región 5'-UTR del gen HA, puede determinar las tasas generales de replicación y transmisión del virus. La sustitución de un nucleótido en la 5'-UTR de una molécula de ARN, conduciría a una disminución de 500 veces en su velocidad de traducción.  Por lo que, se supone  que la estructura de la 5'-UTR del ARN de la cadena plus de Hemaglutinina determina la eficiencia de traducción de la proteína Hemaglutinina, así como la eficiencia de replicación del virus completo.

Ensayo de transcripción / traducción acoplado in vitro con secuencias representativas de HA 5'-UTR.

Imagen tomada con fines educativos de: https://link.springer.com/article/10.1186/s40249-015-0083-8

Referencias Bibliográficas:

1. Zhang, ZW., Liu, T., Zeng, J. et al. Prediction of the next highly pathogenic avian influenza pandemic that can cause illness in humans. Infect Dis Poverty [Internet]. 2015 [citado el 25 de oct de 2019]; 4: 50. Disponible en: https://link.springer.com/article/10.1186/s40249-015-0083-8

Alteraciones de la Transcripción en Neumonía a causa del Virus de la Influenza

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Los estudios de factores transcrpcionales permiten tener información acerca de la respuesta inmune que presentará el hospedador. La inflamación provocada por el Virus de la Influenza tipo A es regulada por los factores de transcripción NFkB, HMGA1 y NFATC4. Por otro lado, las infecciones asintomáticas se asocian con la inducción de reguladores negativos de las señales inflamatorias, especialmente NLRP3 y NOD2. Muchos factores de transcripción, incluidos IRF7, STAT1 y NFkB1, son inducidos por todas las cepas. 

Perfiles de expresión de ARNm para factores de transcripción modulador por Virus de Influenza A en puntos de tiempo tardío.

Imagen tomada con fines académicos de https://link.springer.com/article/10.1186/s12865-015-0107-y

Referencias Bibliográficas.

1. Thakar J,. Hartmann B.M, y Marjanovic N. Comparative analysis of anti-viral transciptomics reveals novel effects of influenza immune antagonism. BMC Immunol [Internet]. 2015 [citado el 19 de Oct de 2019]; 16:46. Disponible en https://link.springer.com/article/10.1186/s12865-015-0107-y

Alteraciones de la Replicación en Neumonía por causa del Virus de la Influenza

                      
La influenza es causada por un virus que pertenece a la familia Orthomixoviridae, el genoma está organizado en ocho fragmentos de ARN sencillo de polaridad negativa. Tres de estos fragmentos codifican para las proteínas PB1, PB2 y PA, responsables tanto de la replicación del genoma como de la expresión del ARN mensajero.  La sustitución de aminoácidos Glu627 por Lys627 en la proteína del complejo polimerasa PB2 se ha asociado con una mayor replicación del virus. Mediante receptores de ácido siálico localizados en la superficie de las células huésped, el virus infecta el sistema respiratorio. 

Imagen tomada con fines educativos de: https://www.researchgate.net/profile/Fernando_Landreau/publication/324223482/figure/fig1/AS:612034366406656@1522931772168/Figura-3-Esquema-del-ciclo-de-replicacion-del-virus-influenza-1-Entrada-del-virus-a.png

Referencias Bibliográficas:

1. Rivera J., Sarmiento L., Parra e., Toro G. Neira M., Méndez J., Barbosa J. y Caldas M. Alteraciones morfológicas en pulmón por la influenza A H1N1/v09 en autopsias, Colombia, 2009. Biomédica [Internet]. 2011 [13 de Oct de 2019]; 31:372-80. Disponible en: http://www.scielo.org.co/pdf/bio/v31n3/v31n3a09.pdf
2. Zhang, ZW., Liu, T., Zeng, J. et al. Prediction of the next highly pathogenic avian influenza pandemic that can cause illness in humans. Infect Dis Poverty [Internet]. 2015 [citado el 25 de oct de 2019]; 4: 50. Disponible en: https://link.springer.com/article/10.1186/s40249-015-0083-8

R

Enfermedad Asignada

Neumonía causada por virus AH1N1

Imagen tomada con fines educativos de:
https://www.intramed.net/UserFiles/vinetas/91311.jpg

La neumonía representa un proceso inflamatorio del pulmón, caracterizado por la
consolidación alveolar debida a la presencia de microorganismos patógenos. Afectan, tanto al niño sano, como al que se encuentra afecto de una situación de inmunodeficiencia, aunque sus efectos y las características de su presentación sean completamente diferentes. Se estima que la neumonía viral por AH1N1 pudo llegar a ser la mitad de los casos de la enfermedad en su tiempo de brote.

Referencias Bibliográficas:
1. Fernández F. y Garro P. Neumonía Vírica en el ámbito de la medicina intensiva [Internet]. España: Sociedad Catalana de Medicina Intensiva i Critica; 2015. . [Citado 06 de Oct de 2019]. Disponible en https://www.academia.cat/files/425-10285-DOCUMENT/llibrece2015.pdf

Bienvenida

Bienvenidos al siguiente blog enfocado en la Biología Molecular y Celular, en el desarrollo del mismo iremos abordando diferentes temas como conceptos, mecanismos moleculares genéticos básicos, técnicas de genética molecular, genética relacionada a la biología molecular, nanomedicina, epigenética, medicina regenerativa, entre otras.  Espero que disfruten el contenido que será publicado semanalmente, y éste sea de utilidad tanto académica como de utilidad práctica.